在細(xì)胞培養(yǎng)的過程中，經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)各種各樣的問題。為了大家能夠更好的進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，本文對(duì)實(shí)驗(yàn)中常出現(xiàn)的問題進(jìn)行了匯總，方便大家查詢和學(xué)習(xí)。
問題1：血清中可能出現(xiàn)的沉淀物是什么？
基于多年的實(shí)驗(yàn)研究，用于細(xì)胞培養(yǎng)的胎牛血清以及其它血清中可能會(huì)存在以下種類的沉淀物：
1、纖維蛋白，它是經(jīng)常出現(xiàn)的較大的沉淀物，可以達(dá)到1-2mm，可以用肉眼觀察到。因?yàn)檠宥际窃诘蜏叵逻M(jìn)行收集和快速處理的，一些纖維蛋白原（可溶性的形成絮狀纖維蛋白的前體）在處理過程中仍然處于溶解狀態(tài)，當(dāng)經(jīng)過MAX后的過濾分裝后，就會(huì)在瓶中凝結(jié)出現(xiàn)纖維蛋白沉淀。
2、磷酸鈣，它也是常見的一種沉淀物，通常會(huì)使血清出現(xiàn)渾濁，并且在37℃培養(yǎng)的時(shí)候會(huì)增加。這種沉淀物在倒置顯微鏡下觀察像小黑點(diǎn)，這些小黑點(diǎn)由于布朗運(yùn)動(dòng)看上去可以活動(dòng)，因此經(jīng)常被誤認(rèn)為是微生物污染。
3、膽固醇、脂肪酸酯以及一些蛋白質(zhì)。他們也是血清中出現(xiàn)沉淀物的常見原因。
問題2：血清中的沉淀物對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)有什么影響？
1、細(xì)胞生長(zhǎng)，我們的試驗(yàn)以及經(jīng)驗(yàn)表明沉淀物不會(huì)影響細(xì)胞培養(yǎng)，我們的客戶以及其它血清生產(chǎn)商也證明了這一點(diǎn)。
2、過濾，如果血清中出現(xiàn)大量的沉淀物，血清將很難過濾。一般說來，因?yàn)樵谘迳a(chǎn)時(shí)MAX后已經(jīng)經(jīng)過100nm或者40nm的過濾處理，并且經(jīng)過了嚴(yán)格的無菌檢測(cè)，因此不推薦再過濾用于細(xì)胞培養(yǎng)的血清。在實(shí)驗(yàn)室中沒有必要再過濾處理血清，以免操作不規(guī)范導(dǎo)致污染的發(fā)生。
3、污染，磷酸鈣往往被誤認(rèn)為微生物污染而引起爭(zhēng)端。研究者可能會(huì)在血清中觀察到一些絮狀的沉淀，因此就會(huì)比較警覺的去做無菌試驗(yàn)，將血清放在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)幾天，結(jié)果可能會(huì)觀察到更多的絮狀沉淀，因此就斷定血清被污染了。并且當(dāng)研究者將血清樣品放在倒置顯微鏡下觀察時(shí)往往可以看到一些可以運(yùn)動(dòng)的小黑點(diǎn)，因此就更加確認(rèn)是血清被污染了。于是，研究者就會(huì)花費(fèi)更多的時(shí)間和精力來和生產(chǎn)商確認(rèn)，但MAX終確定血清沒有被污染而只是沉淀。為了避免這些問題的發(fā)生，我們建議不要直接將血清放在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)觀察是否有菌，而是將血清加到瓊脂板上進(jìn)行培養(yǎng)以觀察是否有細(xì)菌生長(zhǎng)。另外，也可以進(jìn)行革蘭氏染色，在油鏡下觀察，以確認(rèn)是否有污染。
問題3：如何避免血清中沉淀物的出現(xiàn)？
首先要注意正確的血清解凍步驟，而且溶解過程中一定要每隔一段時(shí)間均勻而緩慢的搖動(dòng)血清。我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在下列情況下沉淀物可能增加，使用中應(yīng)該盡量避免：
1、熱滅活血清；
2、使用電熱恒溫培養(yǎng)箱在37℃下培養(yǎng)血清；
3、反復(fù)凍融；
4、γ射線照射；
5、長(zhǎng)期儲(chǔ)存在2-8℃；
6、在室溫下放置時(shí)間過長(zhǎng)
問題4：如何去除血清中的沉淀？
如果想去除這些絮狀沉淀物，可以將血清分裝到無菌離心管中，以400g離心1~2min，上清液即可直接加入到培養(yǎng)基內(nèi)使用。
注意：不要以過濾的方式去除這些絮狀沉淀物，因?yàn)檫@可能阻塞濾膜。
問題5：凍存管應(yīng)如何解凍？
取出凍存管后，須立即放入37°C水槽中快速解凍，輕搖凍存管使其在1分鐘內(nèi)全部融化，并注意水面不可超過凍存管蓋沿，否則易發(fā)生污染情形。另凍存管由液氮桶中取出解凍時(shí)，必須注意安全，預(yù)防凍存管發(fā)生爆裂。
問題6：細(xì)胞凍存管解凍培養(yǎng)時(shí)，是否應(yīng)馬上去除DMSO？
除少數(shù)特別注明對(duì)DMSO敏感的細(xì)胞外，絕大部分細(xì)胞株（包括懸浮細(xì)胞），在解凍后，都應(yīng)直接放入含有10-15ml新鮮培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，待隔天再置換新鮮培養(yǎng)基以去除DMSO即可，如此可避免大部分解凍后細(xì)胞無法生長(zhǎng)或貼附的問題。
問題7：一般在拿到細(xì)胞后，應(yīng)該注意什么？
收到細(xì)胞后先不要開蓋，放在二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)靜置若干小時(shí)后（看細(xì)胞密度而定）在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，并對(duì)細(xì)胞進(jìn)行不同倍數(shù)拍照（建議對(duì)收細(xì)胞時(shí)的培養(yǎng)基拍一張照片，觀察培養(yǎng)基的顏色和是否有漏液情況，顯微鏡下拍細(xì)胞100X，200X各一張），排除細(xì)胞本身污染的情況；收到細(xì)胞未開封，出現(xiàn)污染狀況一般可以再申請(qǐng)免費(fèi)發(fā)送一株細(xì)胞。
收到細(xì)胞時(shí)如無異常情況，請(qǐng)?jiān)陲@微鏡下觀察細(xì)胞密度，如為貼壁細(xì)胞，未超過80%匯合度時(shí)，將培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)液吸出，留下10ml培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)；超過80%匯合度時(shí)，請(qǐng)按細(xì)胞培養(yǎng)條件傳代培養(yǎng)。如為懸浮細(xì)胞，吸出培養(yǎng)液、1000轉(zhuǎn)/分鐘離心2分鐘，吸出上清，管底細(xì)胞用新鮮培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞后移回培養(yǎng)瓶。
細(xì)胞消化液建議使用PBS配制，慎用Hanks液配制。
問題8：可否使用與原先培養(yǎng)條件不同的培養(yǎng)基？
一般不建議。每一細(xì)胞株均有其特定使用且已適應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)基，若驟然使用和原先提供的培養(yǎng)條件不同的培養(yǎng)基，細(xì)胞大都無法立即適應(yīng)，造成細(xì)胞無法存活。
問題9：可否使用與原先培養(yǎng)條件不同的血清種類？
不能。血清是細(xì)胞培養(yǎng)上一個(gè)極為重要的營(yíng)養(yǎng)來源，所以血清的種類和品質(zhì)對(duì)于細(xì)胞的生長(zhǎng)會(huì)產(chǎn)生極大的影響。來自不同物種的血清，在一些物質(zhì)或分子的量或內(nèi)容物上都有所不同，血清使用錯(cuò)誤常會(huì)造成細(xì)胞無法存活。
問題10：L-谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)中重要嗎？它在溶液中不穩(wěn)定嗎？
L-谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)是重要的。脫掉氨基后，L-谷氨酰胺可作為培養(yǎng)細(xì)胞的能量來源、參與蛋白質(zhì)的合成和核酸代謝。L-谷氨酰胺在溶液中經(jīng)過一段時(shí)間后會(huì)降解，但是確切的降解率一直沒有MAX終定論。L-谷氨酰胺的降解導(dǎo)致氨的形成，而氨對(duì)于一些細(xì)胞具有毒性。
問題11：培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)應(yīng)使用5%或10%CO2？或根本沒有影響？
一般培養(yǎng)基中大都使用HCO3-/CO32-/H+作為pH的緩沖系統(tǒng)，而培養(yǎng)基中NaHCO3的含量將決定細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)應(yīng)使用的CO2濃度。當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCO3含量為每公升3.7g時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)應(yīng)使用10%CO2；當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCO3為每公升1.5g時(shí)，則應(yīng)使用5CO2培養(yǎng)細(xì)胞。
問題12：何時(shí)須更換培養(yǎng)基？
視細(xì)胞生長(zhǎng)密度而定，或遵照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上的更換時(shí)間，按時(shí)更換培養(yǎng)基即可。
問題13：培養(yǎng)基中是否須添加抗生素？
除于特殊篩選系統(tǒng)中外，一般正常培養(yǎng)狀態(tài)下，培養(yǎng)基中不應(yīng)添加任何抗生素。
如果是沒有進(jìn)行過細(xì)胞培養(yǎng)的新手，對(duì)無菌技術(shù)沒有信心的，或者提取的原代細(xì)胞，怕污染的，可以適量添加抗生素。
抗生素本身也是有毒性的，有些抗生素的藥效濃度水平與毒效濃度水平非常接近，對(duì)細(xì)胞多少有傷害。
問題14：懸浮性細(xì)胞應(yīng)如何傳代處理？
一般僅需持續(xù)加入新鮮培養(yǎng)基于原培養(yǎng)角瓶中，稀釋細(xì)胞濃度即可，若培養(yǎng)液太多時(shí)，可將培養(yǎng)角瓶口端稍微抬高，直到無法容納為止。分瓶時(shí)取出一部份含細(xì)胞之培養(yǎng)液至另一新的培養(yǎng)角瓶，加入新鮮培養(yǎng)基稀釋至適當(dāng)濃度，重復(fù)前述步驟即可。
問題15：想將一般動(dòng)物細(xì)胞離心下來，其離心速率應(yīng)為多少轉(zhuǎn)速？
回收動(dòng)物細(xì)胞，其離心速率一般為300xg(約1000rpm)，5-10分鐘，過高之轉(zhuǎn)速，將造成細(xì)胞死亡。
問題16：細(xì)胞的接種密度為何？
依照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上之接種密度或稀釋分盤之比例接種即可。細(xì)胞數(shù)太少或稀釋的太多亦是造成細(xì)胞無法生長(zhǎng)之一重要原因。
問題17：細(xì)胞冷凍培養(yǎng)基之成份為何？
動(dòng)物細(xì)胞冷凍保存時(shí)MAX常使用的冷凍培養(yǎng)基是含5-10%DMSO(dimethylsulfoxide)和90-95%原來細(xì)胞生長(zhǎng)用之新鮮培養(yǎng)基均勻混合之。注意：由于DMSO稀釋時(shí)會(huì)放出大量熱能，故不可將DMSO直接加入細(xì)胞液中，必須使用前先行配制完成。
問題18：冷凍保存細(xì)胞的方法？
冷凍保存方法一:冷凍管置于4°C30-0分鐘→(-20°C30分鐘*)→-80°C16~18小時(shí)(或隔夜)→液氮槽vaporphase長(zhǎng)期儲(chǔ)存。冷凍保存方法二:冷凍管置于已設(shè)定程序之可程序降溫機(jī)中每分鐘降1-3°C至–80°C以下，再放入液氮槽vaporphase長(zhǎng)期儲(chǔ)存。-20°C不可超過1小時(shí)，以防止冰晶過大，造成細(xì)胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80°C冰箱中，惟存活率稍微降低一些。
問題19：細(xì)胞要冷凍保存時(shí)，細(xì)胞冷凍管內(nèi)應(yīng)有多少細(xì)胞濃度？
冷凍管內(nèi)細(xì)胞數(shù)目一般為1x106cells/mlvial，融合瘤細(xì)胞則以5x106cells/mlvial為宜。
問題20：應(yīng)如何避免細(xì)胞污染？
細(xì)胞污染的種類可分成細(xì)菌、酵母菌、霉菌、病毒、原蟲、支原體。主要的污染原因?yàn)闊o菌操作技術(shù)不當(dāng)、操作室環(huán)境不佳、污染的血清和污染的細(xì)胞等。嚴(yán)格的無菌操作技術(shù)、清潔的環(huán)境、與品質(zhì)良好的細(xì)胞來源和培養(yǎng)基配制是減低污染MAX適合的方法。
